膜結(jié)合細(xì)胞器和內(nèi)膜系統(tǒng)的研究方法
雖然電子顯微鏡能夠獲得高度清晰的細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)，但是不能研究單個(gè)膜結(jié)合細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和功能。離心分離技術(shù)、同位素示蹤技術(shù)和突變技術(shù)是有效的研究?jī)?nèi)膜系統(tǒng)的方法。
■ 放射自顯影術(shù)（autoradiography）
胰腺系統(tǒng)中胰泡細(xì)胞具有最發(fā)達(dá)的內(nèi)膜系統(tǒng)， 主要功能是合成消化酶類。這些酶類合成之后要從胰腺系統(tǒng)經(jīng)由導(dǎo)管分泌到小腸中行使功能。這些酶是如何分泌出去的？ Jamws Jamieson 和George Palade使用放射自顯影技術(shù)證明了蛋白質(zhì)分泌起始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，經(jīng)高爾基體到達(dá)細(xì)胞外?！ ?BR> ■ 差速離心分離與功能分析
● 微粒體（microsomes）分離
雖然放射自顯影技術(shù)證明了分泌蛋白合成的起始部位，但不能證明合成分泌蛋白的是何種細(xì)胞器。Albert Claude和Christian De Duve發(fā)展了細(xì)胞組份分離技術(shù)，分離到了具有蛋白質(zhì)合成和分泌功能的結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)稱為微粒體。
用機(jī)械勻漿將細(xì)胞破碎，各種膜細(xì)胞器破碎，并且重新自我融合形成各種球形膜泡，通過(guò)較高速度離心除去細(xì)胞核、線粒體、過(guò)氧化物酶體等細(xì)胞器。收集懸浮液再用較低速度離心，然后用電子顯微鏡檢查離心后分開的兩部分結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)上層的囊泡表面是光滑的，沉淀下的囊泡表面有核糖體顆粒。
● 微粒體的功能研究
通過(guò)差速離心分離的微粒體不僅保留了膜的結(jié)構(gòu)特征，同時(shí)還具有活細(xì)胞中的生物活性和功能。如來(lái)自高爾基體的囊泡具有將蛋白質(zhì)和脂進(jìn)行糖基化修飾的作用。用從這些囊泡中分離的特殊蛋白作為抗原制備抗體，然后將制備的抗體與特定的顆粒如金顆粒結(jié)合，再通過(guò)免疫電鏡技術(shù)就能夠?qū)τ米骺乖拿高M(jìn)行定位，通過(guò)這些研究詳細(xì)揭示了高爾基體在復(fù)雜的糖裝配中的具體過(guò)程。
■ 用突變體研究?jī)?nèi)膜系統(tǒng)的功能
為了研究編碼與分泌途徑相關(guān)蛋白的基因，科學(xué)家們篩選了一些突變體，在這些突變體中，內(nèi)膜結(jié)構(gòu)不正常。如獲得的涉及ER出芽小泡形成基因發(fā)生突變酵母突變體的ER就特別大； 若是涉及與高爾基體融合的基因突變，這種酵母突變體中就會(huì)積累大量的分泌泡。通過(guò)對(duì)酵母突變體的研究， 揭示了小泡運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程（圖9-8）。
野生型是分泌正常的酵母，A、B、C、D、E是五類不同的sec基因（secretory genes）突變，代表了蛋白質(zhì)分泌的五個(gè)過(guò)程。A：分泌蛋白不能進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，B： 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出芽缺陷，C：分泌小泡不能與高爾基體融合：D：高爾基體不能形成分泌泡；E：分泌泡不能與質(zhì)膜融合。
目前已經(jīng)分離和克隆了幾十個(gè)與分泌途徑相關(guān)的基因，通過(guò)序列分析，表明這些基因與哺乳動(dòng)物分泌基因具有同源性， 推測(cè)哺乳動(dòng)物的細(xì)胞分泌過(guò)程與酵母相似。
雖然電子顯微鏡能夠獲得高度清晰的細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)，但是不能研究單個(gè)膜結(jié)合細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和功能。離心分離技術(shù)、同位素示蹤技術(shù)和突變技術(shù)是有效的研究?jī)?nèi)膜系統(tǒng)的方法。
■ 放射自顯影術(shù)（autoradiography）
胰腺系統(tǒng)中胰泡細(xì)胞具有最發(fā)達(dá)的內(nèi)膜系統(tǒng)， 主要功能是合成消化酶類。這些酶類合成之后要從胰腺系統(tǒng)經(jīng)由導(dǎo)管分泌到小腸中行使功能。這些酶是如何分泌出去的？ Jamws Jamieson 和George Palade使用放射自顯影技術(shù)證明了蛋白質(zhì)分泌起始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，經(jīng)高爾基體到達(dá)細(xì)胞外?！ ?BR> ■ 差速離心分離與功能分析
● 微粒體（microsomes）分離
雖然放射自顯影技術(shù)證明了分泌蛋白合成的起始部位，但不能證明合成分泌蛋白的是何種細(xì)胞器。Albert Claude和Christian De Duve發(fā)展了細(xì)胞組份分離技術(shù)，分離到了具有蛋白質(zhì)合成和分泌功能的結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)稱為微粒體。
用機(jī)械勻漿將細(xì)胞破碎，各種膜細(xì)胞器破碎，并且重新自我融合形成各種球形膜泡，通過(guò)較高速度離心除去細(xì)胞核、線粒體、過(guò)氧化物酶體等細(xì)胞器。收集懸浮液再用較低速度離心，然后用電子顯微鏡檢查離心后分開的兩部分結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)上層的囊泡表面是光滑的，沉淀下的囊泡表面有核糖體顆粒。
● 微粒體的功能研究
通過(guò)差速離心分離的微粒體不僅保留了膜的結(jié)構(gòu)特征，同時(shí)還具有活細(xì)胞中的生物活性和功能。如來(lái)自高爾基體的囊泡具有將蛋白質(zhì)和脂進(jìn)行糖基化修飾的作用。用從這些囊泡中分離的特殊蛋白作為抗原制備抗體，然后將制備的抗體與特定的顆粒如金顆粒結(jié)合，再通過(guò)免疫電鏡技術(shù)就能夠?qū)τ米骺乖拿高M(jìn)行定位，通過(guò)這些研究詳細(xì)揭示了高爾基體在復(fù)雜的糖裝配中的具體過(guò)程。
■ 用突變體研究?jī)?nèi)膜系統(tǒng)的功能
為了研究編碼與分泌途徑相關(guān)蛋白的基因，科學(xué)家們篩選了一些突變體，在這些突變體中，內(nèi)膜結(jié)構(gòu)不正常。如獲得的涉及ER出芽小泡形成基因發(fā)生突變酵母突變體的ER就特別大； 若是涉及與高爾基體融合的基因突變，這種酵母突變體中就會(huì)積累大量的分泌泡。通過(guò)對(duì)酵母突變體的研究， 揭示了小泡運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程（圖9-8）。
野生型是分泌正常的酵母，A、B、C、D、E是五類不同的sec基因（secretory genes）突變，代表了蛋白質(zhì)分泌的五個(gè)過(guò)程。A：分泌蛋白不能進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，B： 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出芽缺陷，C：分泌小泡不能與高爾基體融合：D：高爾基體不能形成分泌泡；E：分泌泡不能與質(zhì)膜融合。
目前已經(jīng)分離和克隆了幾十個(gè)與分泌途徑相關(guān)的基因，通過(guò)序列分析，表明這些基因與哺乳動(dòng)物分泌基因具有同源性， 推測(cè)哺乳動(dòng)物的細(xì)胞分泌過(guò)程與酵母相似。