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一、鑒別試驗
鑒別就是利用化學法、物理法及生物學方法來確證生化藥物的真?zhèn)?。通常，需用標準品或?qū)φ掌吩谕粭l件下進行對照試驗。現(xiàn)將常用的鑒別方法簡述如下。
1.化學反應(yīng)法 通常利用藥物與某試劑在一定條件下反應(yīng)，生成有顏色的產(chǎn)物或沉淀進行鑒別。例如，溶菌酶的鑒別采用呈色法：溶菌酶分子中的四個肽鍵上的氮原子能與銅離子（Cu2＋）絡(luò)合，生成有顏色的絡(luò)合物，肽鍵越多，產(chǎn)生的顏色越深。胃蛋白酶的鑒別采用沉淀法：胃蛋白酶是具有高效、專一催化活性的特殊蛋白質(zhì)，易受酸、堿、重金屬或有機溶劑等的作用，破壞蛋白質(zhì)肽鏈的空間結(jié)構(gòu)，引起蛋白質(zhì)變性，生成不溶性的沉淀。
2.紫外分光光度法 三磷酸腺苷二鈉的分子中具有共軛系統(tǒng)，能吸收紫外光。本品的0.01mol／L鹽酸水溶液（20μg／ml），在（257±1）nm的波長處有大吸收。A250nm／A260nm的值應(yīng)為0.17～0.27。
3．酶法 尿激酶是專屬性較強的蛋白水解酶，根據(jù)尿激酶能激活牛纖維蛋白溶酶原，而具有相同作用的鏈激酶不能激活牛纖維蛋白溶酶原而加以區(qū)別，并用直接觀察溶解纖維蛋白作用的氣泡上升法作為判斷指標。
4.電泳法 肝素的鑒別采用糖凝膠電泳法：肝素是由D-硫酸氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸分子間組成的酸性粘多糖，其水溶液帶強負電荷，于瓊脂凝膠板上，在電場作用下，向正極方向移動，與肝素國家標準品對照，其移動位置應(yīng)相應(yīng)，
5. 生物法利用生物體進行試驗來鑒別藥物。例如，用家兔驚厥試驗來鑒別胰島素，是通過胰島素的降血糖作用進行鑒別的，當劑量過大，血糖降低至一定水平（約30％），家兔即發(fā)生驚厥，迅速靜注50％葡萄糖注射液，補充血糖，驚厥停止，說明驚厥是胰島素所致低血糖而引起的。又如，根據(jù)肝素鈣具有延長血凝時間的特性進行鑒別。
應(yīng)該指出，由于生化藥物的結(jié)構(gòu)復雜，仍有一部分生化藥物目前還未找到有效的鑒別方法。例如糜蛋白酶、糜胰蛋白酶、胰蛋白酶等。
二、雜質(zhì)檢查 生化藥物分子較大，結(jié)構(gòu)復雜，有時成分并非單一，純化工藝較難，因此，生化藥物的雜質(zhì)檢查就顯得非常重要。
1．一般雜質(zhì)檢查 生化藥物的一般雜質(zhì)檢查項目包括氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽、銨鹽、鐵鹽、重金屬、酸度、溶液的澄清度或溶液的顏色、水分及干燥失重、熾灼殘渣等。其檢查的原理及方法與化學藥物中的一般雜質(zhì)檢查相同，不再贅述。
2．特殊雜質(zhì)檢查特殊雜質(zhì)主要是指從生產(chǎn)工藝中引入或原料中帶入的雜質(zhì)。許多生化藥物是從生物組織中提取或用微生物發(fā)酵法制得，藥物中易殘存一些雜質(zhì)或其他成分。例如，胰蛋白酶是從動物膜中提取制得的一種蛋白水解酶，在制備過程中．易帶入雜質(zhì)糜蛋白酶，中國藥典（1995年版）和USP（23）均規(guī)定要檢查此酶，根據(jù)胰蛋白酶的特性選用N-乙酰-L-酪氨酸乙酯為底物作糜蛋白酶的限度檢查。糜蛋白酶的限度為2500個胰蛋白酶單位中不得大于50單位，按每1mg胰蛋白酶為 2500個單位和每1mg糜蛋白酶為1000單位，折算成重量，則糜蛋白酶的限度為5％（g／g）。
三、安全性檢查
1.熱原檢查法（家兔法） 本法是將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內(nèi)，以其體溫升高的程度，判定該供試品中所含熱原是否符合規(guī)定，是一種限度試驗法。
（1）檢查法：取適用的家兔3只，測定其正常體溫后15min以內(nèi)，自耳靜脈緩緩注入規(guī)定劑量并溫熱至約38℃的供試品溶液，然后每隔1h按前法測量其體溫1次，共測3次，從3次體溫中高的減去正常體溫，即為該兔體溫的升高度數(shù)。如3只家兔中有1只體溫升高0.6℃或以上，或3只家兔體溫升高均低于 0.6℃，但升高的總數(shù)達1.4℃或1.4℃以上，應(yīng)另取5只家兔復試，檢查方法同上。
（2）結(jié)果判斷：在初試3只家兔中，體溫升高均低于0.6℃，并且3只家兔體溫升高總數(shù)低于1.4℃；或在復試的5只家兔中，體溫升高0.6℃或0.6℃ 以上的家兔數(shù)僅有1只，并且初試、復試合并8只家兔的體溫升高總數(shù)為3.5℃或3.5℃以下，均認為供試品的熱原檢查符合規(guī)定。
2. 異常毒性試驗異常毒性試驗是用一定劑量的藥物按指定的操作方法和給藥途徑給予規(guī)定體重的某種試驗動物，觀察其急性毒性反應(yīng)。反應(yīng)的判斷以試驗動物死亡與否為終點。中國藥典規(guī)定的異常毒性試驗，實際上是一個限度試驗。在此劑量條件下，一般供試品不應(yīng)使試驗動物中毒致死；如果出現(xiàn)試驗動物急性中毒而死亡，則反映該供試品中含有的急性毒性物質(zhì)超過了正常水平，因此，本試驗又稱異常毒性檢查法。在出現(xiàn)試驗動物死亡時，除動物試驗方法存在的差異或偶然差錯外，主要決定于供試品在生產(chǎn)過程中是否帶入可引發(fā)異常毒性反應(yīng)的雜質(zhì)。異常毒性試驗的動物為小白鼠。試驗操作方法有尾靜脈注射法、皮下注射法、腹腔注射法及口服給藥法等。
中國藥典（1995年版）中規(guī)定了50多種藥物需做異常毒性檢查。例如，玻璃酸酶的異常毒性檢查方法如下：
取體重17～22g的健康小白鼠5只，分別由皮下注射每lml中含玻璃酸酶10000單位的氯化鈉注射液0.25時，48hr內(nèi)不得發(fā)生皮下組織壞死或死亡，如有一只小白鼠發(fā)生組織壞死或死亡，應(yīng)按上述方法復試，全部小白鼠在48h內(nèi)不得有組織壞死或死亡現(xiàn)象。
3．過敏試驗過敏試驗是檢查異性蛋白的試驗。藥物中若夾雜有異性蛋白，在臨床使用時易引起病人多種過敏反應(yīng)，輕者皮膚出現(xiàn)紅斑或丘疹，嚴重者可出現(xiàn)窒息、發(fā)結(jié)、血管神經(jīng)性水腫、血壓下降，甚至休克和死亡。因此，有可能存在異性蛋白的藥物、應(yīng)作過敏試驗。例如，細胞色素C是蛋白制劑，在制備中可能摻入少量雜蛋白，為保證使用安全，中國藥典規(guī)定細胞色素C溶液及細胞色素C注射液應(yīng)做過敏試驗。方法如下：
取本品適量，加滅菌注射用水稀釋成每1ml中含細胞色素C7．5mg的溶液，作為致敏液與供試品溶液。另取體重為250～350g的健康豚鼠6只，連續(xù)3 次隔日腹腔注射致敏液0．5時，2周后，再自股（耳）靜脈注射供試品溶液1時，注射后15min內(nèi)，均不得出現(xiàn)過敏性反應(yīng)。如有豎毛、呼吸困難、噴嚏、干嘔或咳嗽三聲等現(xiàn)象中的兩種或兩種以上者，或有抽搐、虛脫或死亡等現(xiàn)象之一者，應(yīng)判為陽性。
4．降壓物質(zhì)檢查法降壓物質(zhì)是指某些藥物中含有的能導致血壓降低的雜質(zhì)，包括組胺、類組胺或其他導致血壓降低的物質(zhì)。在用動物臟器或組織為原料制備生化藥物的過程中，正常組織內(nèi)存在的組胺及部分氨基酸脫羧形成的組胺、酪胺等膠類物質(zhì)，均為這類雜質(zhì)的來源。以組胺為代表的胺類，具有剌激支氣管、腸管平滑肌，擴張毛細血管及人類小動脈的作用，注入體內(nèi)能導致人、狗、貓或猴的血壓下降。臨床上注射染有此類降壓物質(zhì)的注射液后，將引起面部潮紅、脈搏加速和血壓下降等不良反應(yīng)。因此，除了從生產(chǎn)工藝上采取有效措施以減少可能的污染外，對有關(guān)藥品中的降壓物質(zhì)進行檢查并控制其限度是十分必要的。中國藥典采用貓（或狗）血壓法檢查藥物如硫酸鏈霉素、硫酸卡那霉素、硫酸慶大霉素等十幾種藥物中所含的降壓物質(zhì)。
5．無菌檢查法無菌檢查法是檢查藥品及敷料是否染有活菌的一種方法，是藥典中較重要的檢查項目之一。由于許多生化藥物是在無菌條件下制備的，且不能高溫滅菌。因此，無菌檢查就更有必要。中國藥典中幾乎所有的注射用藥如注射用尿激酶等，均做無菌檢查。由于取樣和試驗方法的局限性，對于保證藥品的無菌要求，首先應(yīng)嚴格執(zhí)行 GMP管理制度，使藥品真正達到無菌，而無菌檢查只是控制這些制品染菌狀況的一種檢測手段。
（1）無菌檢查的基本步驟：①培養(yǎng)基的制備，為細菌生長、繁殖提供所必需的營養(yǎng)物質(zhì)一碳源、氮源、維生素、礦物質(zhì)等。②選擇對照用菌液，供對照試驗用。③具體檢查，如接種、培養(yǎng)等操作。④結(jié)果判斷，得出陰性或陽性的結(jié)論。
（2）注意事項：①無菌檢查的全部過程應(yīng)嚴格遵守無菌操作法，包括對操作環(huán)境、試驗材料及用具酶滅菌等，防止微生物污染。②應(yīng)避免在有抑菌條件下操作。③從事無菌操作人員應(yīng)具備微生物學的基礎(chǔ)知識及一定工作經(jīng)驗，否則要經(jīng)過無菌技能的培訓，方能從事此工作。
四、含量（效價）測定
生化藥物的含量表示方法通常有兩種：一種用百分含量表示，適用于結(jié)構(gòu)明確的小分子藥物或經(jīng)水解后變成小分子的藥物。另一種用生物效價或酶活力單位表示，適用于酶類、蛋白質(zhì)類等藥物。常用的定量分析法將在第三節(jié)中介紹。
一、鑒別試驗
鑒別就是利用化學法、物理法及生物學方法來確證生化藥物的真?zhèn)?。通常，需用標準品或?qū)φ掌吩谕粭l件下進行對照試驗。現(xiàn)將常用的鑒別方法簡述如下。
1.化學反應(yīng)法 通常利用藥物與某試劑在一定條件下反應(yīng)，生成有顏色的產(chǎn)物或沉淀進行鑒別。例如，溶菌酶的鑒別采用呈色法：溶菌酶分子中的四個肽鍵上的氮原子能與銅離子（Cu2＋）絡(luò)合，生成有顏色的絡(luò)合物，肽鍵越多，產(chǎn)生的顏色越深。胃蛋白酶的鑒別采用沉淀法：胃蛋白酶是具有高效、專一催化活性的特殊蛋白質(zhì)，易受酸、堿、重金屬或有機溶劑等的作用，破壞蛋白質(zhì)肽鏈的空間結(jié)構(gòu)，引起蛋白質(zhì)變性，生成不溶性的沉淀。
2.紫外分光光度法 三磷酸腺苷二鈉的分子中具有共軛系統(tǒng)，能吸收紫外光。本品的0.01mol／L鹽酸水溶液（20μg／ml），在（257±1）nm的波長處有大吸收。A250nm／A260nm的值應(yīng)為0.17～0.27。
3．酶法 尿激酶是專屬性較強的蛋白水解酶，根據(jù)尿激酶能激活牛纖維蛋白溶酶原，而具有相同作用的鏈激酶不能激活牛纖維蛋白溶酶原而加以區(qū)別，并用直接觀察溶解纖維蛋白作用的氣泡上升法作為判斷指標。
4.電泳法 肝素的鑒別采用糖凝膠電泳法：肝素是由D-硫酸氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸分子間組成的酸性粘多糖，其水溶液帶強負電荷，于瓊脂凝膠板上，在電場作用下，向正極方向移動，與肝素國家標準品對照，其移動位置應(yīng)相應(yīng)，
5. 生物法利用生物體進行試驗來鑒別藥物。例如，用家兔驚厥試驗來鑒別胰島素，是通過胰島素的降血糖作用進行鑒別的，當劑量過大，血糖降低至一定水平（約30％），家兔即發(fā)生驚厥，迅速靜注50％葡萄糖注射液，補充血糖，驚厥停止，說明驚厥是胰島素所致低血糖而引起的。又如，根據(jù)肝素鈣具有延長血凝時間的特性進行鑒別。
應(yīng)該指出，由于生化藥物的結(jié)構(gòu)復雜，仍有一部分生化藥物目前還未找到有效的鑒別方法。例如糜蛋白酶、糜胰蛋白酶、胰蛋白酶等。
二、雜質(zhì)檢查 生化藥物分子較大，結(jié)構(gòu)復雜，有時成分并非單一，純化工藝較難，因此，生化藥物的雜質(zhì)檢查就顯得非常重要。
1．一般雜質(zhì)檢查 生化藥物的一般雜質(zhì)檢查項目包括氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽、銨鹽、鐵鹽、重金屬、酸度、溶液的澄清度或溶液的顏色、水分及干燥失重、熾灼殘渣等。其檢查的原理及方法與化學藥物中的一般雜質(zhì)檢查相同，不再贅述。
2．特殊雜質(zhì)檢查特殊雜質(zhì)主要是指從生產(chǎn)工藝中引入或原料中帶入的雜質(zhì)。許多生化藥物是從生物組織中提取或用微生物發(fā)酵法制得，藥物中易殘存一些雜質(zhì)或其他成分。例如，胰蛋白酶是從動物膜中提取制得的一種蛋白水解酶，在制備過程中．易帶入雜質(zhì)糜蛋白酶，中國藥典（1995年版）和USP（23）均規(guī)定要檢查此酶，根據(jù)胰蛋白酶的特性選用N-乙酰-L-酪氨酸乙酯為底物作糜蛋白酶的限度檢查。糜蛋白酶的限度為2500個胰蛋白酶單位中不得大于50單位，按每1mg胰蛋白酶為 2500個單位和每1mg糜蛋白酶為1000單位，折算成重量，則糜蛋白酶的限度為5％（g／g）。
三、安全性檢查
1.熱原檢查法（家兔法） 本法是將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內(nèi)，以其體溫升高的程度，判定該供試品中所含熱原是否符合規(guī)定，是一種限度試驗法。
（1）檢查法：取適用的家兔3只，測定其正常體溫后15min以內(nèi)，自耳靜脈緩緩注入規(guī)定劑量并溫熱至約38℃的供試品溶液，然后每隔1h按前法測量其體溫1次，共測3次，從3次體溫中高的減去正常體溫，即為該兔體溫的升高度數(shù)。如3只家兔中有1只體溫升高0.6℃或以上，或3只家兔體溫升高均低于 0.6℃，但升高的總數(shù)達1.4℃或1.4℃以上，應(yīng)另取5只家兔復試，檢查方法同上。
（2）結(jié)果判斷：在初試3只家兔中，體溫升高均低于0.6℃，并且3只家兔體溫升高總數(shù)低于1.4℃；或在復試的5只家兔中，體溫升高0.6℃或0.6℃ 以上的家兔數(shù)僅有1只，并且初試、復試合并8只家兔的體溫升高總數(shù)為3.5℃或3.5℃以下，均認為供試品的熱原檢查符合規(guī)定。
2. 異常毒性試驗異常毒性試驗是用一定劑量的藥物按指定的操作方法和給藥途徑給予規(guī)定體重的某種試驗動物，觀察其急性毒性反應(yīng)。反應(yīng)的判斷以試驗動物死亡與否為終點。中國藥典規(guī)定的異常毒性試驗，實際上是一個限度試驗。在此劑量條件下，一般供試品不應(yīng)使試驗動物中毒致死；如果出現(xiàn)試驗動物急性中毒而死亡，則反映該供試品中含有的急性毒性物質(zhì)超過了正常水平，因此，本試驗又稱異常毒性檢查法。在出現(xiàn)試驗動物死亡時，除動物試驗方法存在的差異或偶然差錯外，主要決定于供試品在生產(chǎn)過程中是否帶入可引發(fā)異常毒性反應(yīng)的雜質(zhì)。異常毒性試驗的動物為小白鼠。試驗操作方法有尾靜脈注射法、皮下注射法、腹腔注射法及口服給藥法等。
中國藥典（1995年版）中規(guī)定了50多種藥物需做異常毒性檢查。例如，玻璃酸酶的異常毒性檢查方法如下：
取體重17～22g的健康小白鼠5只，分別由皮下注射每lml中含玻璃酸酶10000單位的氯化鈉注射液0.25時，48hr內(nèi)不得發(fā)生皮下組織壞死或死亡，如有一只小白鼠發(fā)生組織壞死或死亡，應(yīng)按上述方法復試，全部小白鼠在48h內(nèi)不得有組織壞死或死亡現(xiàn)象。
3．過敏試驗過敏試驗是檢查異性蛋白的試驗。藥物中若夾雜有異性蛋白，在臨床使用時易引起病人多種過敏反應(yīng)，輕者皮膚出現(xiàn)紅斑或丘疹，嚴重者可出現(xiàn)窒息、發(fā)結(jié)、血管神經(jīng)性水腫、血壓下降，甚至休克和死亡。因此，有可能存在異性蛋白的藥物、應(yīng)作過敏試驗。例如，細胞色素C是蛋白制劑，在制備中可能摻入少量雜蛋白，為保證使用安全，中國藥典規(guī)定細胞色素C溶液及細胞色素C注射液應(yīng)做過敏試驗。方法如下：
取本品適量，加滅菌注射用水稀釋成每1ml中含細胞色素C7．5mg的溶液，作為致敏液與供試品溶液。另取體重為250～350g的健康豚鼠6只，連續(xù)3 次隔日腹腔注射致敏液0．5時，2周后，再自股（耳）靜脈注射供試品溶液1時，注射后15min內(nèi)，均不得出現(xiàn)過敏性反應(yīng)。如有豎毛、呼吸困難、噴嚏、干嘔或咳嗽三聲等現(xiàn)象中的兩種或兩種以上者，或有抽搐、虛脫或死亡等現(xiàn)象之一者，應(yīng)判為陽性。
4．降壓物質(zhì)檢查法降壓物質(zhì)是指某些藥物中含有的能導致血壓降低的雜質(zhì)，包括組胺、類組胺或其他導致血壓降低的物質(zhì)。在用動物臟器或組織為原料制備生化藥物的過程中，正常組織內(nèi)存在的組胺及部分氨基酸脫羧形成的組胺、酪胺等膠類物質(zhì)，均為這類雜質(zhì)的來源。以組胺為代表的胺類，具有剌激支氣管、腸管平滑肌，擴張毛細血管及人類小動脈的作用，注入體內(nèi)能導致人、狗、貓或猴的血壓下降。臨床上注射染有此類降壓物質(zhì)的注射液后，將引起面部潮紅、脈搏加速和血壓下降等不良反應(yīng)。因此，除了從生產(chǎn)工藝上采取有效措施以減少可能的污染外，對有關(guān)藥品中的降壓物質(zhì)進行檢查并控制其限度是十分必要的。中國藥典采用貓（或狗）血壓法檢查藥物如硫酸鏈霉素、硫酸卡那霉素、硫酸慶大霉素等十幾種藥物中所含的降壓物質(zhì)。
5．無菌檢查法無菌檢查法是檢查藥品及敷料是否染有活菌的一種方法，是藥典中較重要的檢查項目之一。由于許多生化藥物是在無菌條件下制備的，且不能高溫滅菌。因此，無菌檢查就更有必要。中國藥典中幾乎所有的注射用藥如注射用尿激酶等，均做無菌檢查。由于取樣和試驗方法的局限性，對于保證藥品的無菌要求，首先應(yīng)嚴格執(zhí)行 GMP管理制度，使藥品真正達到無菌，而無菌檢查只是控制這些制品染菌狀況的一種檢測手段。
（1）無菌檢查的基本步驟：①培養(yǎng)基的制備，為細菌生長、繁殖提供所必需的營養(yǎng)物質(zhì)一碳源、氮源、維生素、礦物質(zhì)等。②選擇對照用菌液，供對照試驗用。③具體檢查，如接種、培養(yǎng)等操作。④結(jié)果判斷，得出陰性或陽性的結(jié)論。
（2）注意事項：①無菌檢查的全部過程應(yīng)嚴格遵守無菌操作法，包括對操作環(huán)境、試驗材料及用具酶滅菌等，防止微生物污染。②應(yīng)避免在有抑菌條件下操作。③從事無菌操作人員應(yīng)具備微生物學的基礎(chǔ)知識及一定工作經(jīng)驗，否則要經(jīng)過無菌技能的培訓，方能從事此工作。
四、含量（效價）測定
生化藥物的含量表示方法通常有兩種：一種用百分含量表示，適用于結(jié)構(gòu)明確的小分子藥物或經(jīng)水解后變成小分子的藥物。另一種用生物效價或酶活力單位表示，適用于酶類、蛋白質(zhì)類等藥物。常用的定量分析法將在第三節(jié)中介紹。