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胞嘧啶脫氨酶基因導入腫瘤細胞可將無毒性的原藥在腫瘤細胞內代謝為具細胞毒的產(chǎn)物而發(fā)揮抗腫瘤效應。本文綜述了該基因的克隆、作用機制和在消化道腫瘤治療中的研究進展。
隨著分子生物學的迅猛發(fā)展，基因治療這一嶄新方法盡管還多處于實驗研究手段，卻已顯示出良好的應用前景。自1991年Huber等提出病毒導向的酶解原藥療法以來，有關的基因研究成為熱門課題。目前，一個新的基因治療系統(tǒng)——EC-CD/5-FC系統(tǒng)正日益受到高度關注。本文就胞嘧啶脫氨酶基因治療消化道腫瘤的現(xiàn)狀作一綜述。
CD基因的克隆
胞嘧啶脫氨酶是大腸桿菌代謝旁路中的一種酶，哺乳動物細胞中不含該酶。Austin等于1992年首先從大腸桿菌株中采用傳統(tǒng)方法提取質粒DNA，進一步分離、純化并轉染宿主菌，初步構建成原核細胞中表達的CD質粒載體，克隆了編碼CD的大腸桿菌基因，利用陽性基因篩選方法，獲得一攜帶10.8kb的DNA插入質粒，其中一3kb的DNA片段保留有CD酶活性。CK蛋白質分子量為52000，DNA序列分析顯示一含427個氨基酸開放讀碼框架編碼CD。
為證實CD基因在真核細胞中表達以發(fā)揮作用，研究者采用寡核苷酸突變技術，將CD基因起始密碼子由GTG→ATG，從而產(chǎn)生一5’起始密碼子，選擇pRc/CMV真核表達載體，構建成真核表達質粒pCMV/CD-1。以脂質體法將pCMV/CD-1導入人結腸癌WiDr細胞系，生長抑制試驗顯示轉染后的結腸癌細胞對5-FC的IC50為30μmol，而未轉染的結腸癌細胞其IC50為17000μmol，表明轉染有CD基因的結腸癌細胞對5-FC的敏感性提高了近560倍。
CD基因轉移方法
安全有效的基因轉移方法是基因治療的關鍵因素之一。至今，作為基因轉移的載體，以病毒性載體介導的方法研究為系統(tǒng)深入，幾乎應用于所有的靶系統(tǒng)。在消化道腫瘤的CD基因治療中，既往的研究仍選擇逆轉錄病毒載體，這與對其基因組結構和生活周期了解得較清楚有關。RV載體大多由Moloney小鼠白血病病毒構建而成，為RNA病毒，基因組編碼在一條單鏈RNA分子上，進入細胞后，逆轉錄成雙鏈DNA，此DNA進入細胞核整合在受體細胞DNA上，并以此為模板合成病毒基因和后代RNA。采用RV轉導CD基因，將CD基因整合于病毒長末端重復的末端，因而整合后的病毒基因結構可受到保護不致受損。
目前轉導CD基因多選擇腺病毒載體。由于腺病毒為一雙鏈DNA病毒，宿主范圍廣泛，尤其能有效地感染非分裂狀態(tài)的細胞，另外，它不能整合到宿主細胞染色體上，因而較逆轉錄病毒更為安全。重組腺病毒載體主要來自于2型和5型腺病毒，容量大，可裝載達7.6kb。已有學者選用Ad載體介導CD基因轉染入結腸癌HT29細胞系，將攜帶有大腸桿菌標記基因的腺病毒注射到腫瘤組織中底物X-gal染色來判斷基因轉染效率。結果顯示外源基因經(jīng)單次注入后近5%-30%的腫瘤組織表達Lacz基因。
作用機制
由于哺乳動物細胞中不存在CD，因而不能將胞嘧啶轉化成尿嘧啶，更不能將5-氟胞嘧啶轉化成5-氟尿嘧啶。但通過基因轉移技術將CD基因轉入哺乳動物細胞，則哺乳動物細胞可將一些原來無毒性的原藥轉化為有細胞毒性的代謝產(chǎn)物，導致細胞自殺性死亡。5-FC在高度抗微生物活性的濃度下對哺乳動物無毒性作用，經(jīng)CD脫氨為5-FU，后者則具有高度細胞毒性，為臨床廣泛使用的抗腫瘤化療藥物。
CD基因作用的一個十分突出特點即所謂的“旁觀者效應”，這與某些自殺基因的作用機制相似。Hirschowitz等早觀察到CD基因治療結腸癌時的這一效應，當CD+的結腸癌細胞與CD-的結腸癌細胞混合時，比較了CD+的細胞比例為10%和100%時兩者的細胞生長抑制水平，結果無顯著性差異。對旁觀者效應尚缺乏確切的解釋，但大多同意“縫隙連接”引起旁觀者效應，通過細胞間的接觸，毒性代謝產(chǎn)物由“縫隙連接”從CD+的細胞轉入CD-的細胞，從而使得后者變得原藥也敏感了，并被原藥代謝產(chǎn)物殺死。但亦有學者提出不同意見，Trinh等通過電鏡發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織鄰近區(qū)域有大量的“橋?！贝嬖?，因其起著封閉細胞間轉運的作用，推測旁觀者效應并非上述機制，尚有其它機制參與，如細胞凋亡、原藥代謝產(chǎn)物本身可穿過細胞膜等可能機制。
幾種消化道腫瘤CD基因治療現(xiàn)狀
結腸癌CD基因治療的研究對象以結腸癌為多。Huber等觀察到*鼠5-FC的半衰腸期大約是40分鐘，腹腔內給予500mg/的5-FC，其血漿水平可維持在4000μmol。體外試驗顯示：對于CD+結腸癌細胞，5-FC的IC50僅為5μmol；而體內試驗結果表明無論是腹腔內還是靜脈內給予5-FC，都同樣觀察到明顯的抗腫瘤效應。
Richard等將組織特異性因子癌胚抗原轉錄調控序列的三個部分分別插入到含CD基因的pCMV/CD-1中，構建了一系列pCEA/CD基因載體，通過分析熒光素活性，篩選出活性高的pCEA/CD-145基因。體外實驗將其轉導入大腸癌NCIH508細胞中，在5-FC存在下，基因表達發(fā)揮出良好的原藥轉換抗腫瘤效應，CD+的NCIH508細胞其IC50＜2μmol，而CD－的NCIH508細胞其IC50達516μmol。體內實驗比較轉導前后的大腸癌細胞*鼠體內成瘤后，給予5-FU500μg(kgd，），連續(xù)20日，細果顯示未轉導CD的大腸癌細胞成瘤*鼠腫瘤重量增加了近3倍，而轉導CD的大腸癌細胞成瘤*鼠腫瘤重量基本未改變。
肝腫瘤肝原發(fā)或繼發(fā)腫瘤的基因治療研究報道多。由于肝臟是結腸癌常轉移的部位，因此，Ohwada等在建立結腸癌肝轉移動物模型的基礎上，給予人結腸癌荷瘤*鼠肝內注射AdCMV.CD和腹腔內每周二次給予5-FC，以點雜交分析肝內人結腸癌細胞DNA數(shù)量來判斷抑制轉移瘤效果。結果與對照組相比，治療組肝內人結腸癌細胞DNA數(shù)量顯著低于各對照組，級組織學檢查顯示治療組注射部位肝腫瘤出現(xiàn)壞死，對照組未見此現(xiàn)象，且治療組中正常肝組織僅見輕微的、可恢復的炎癥，未見壞死。
近，Kanai等報道選擇甲胎蛋白啟動子/增強子，構建重組腺病毒載體AdAFP-CD和AdAFP-Lacz，分別轉染AFP+的肝癌細胞系和AFP-的肝癌細胞系，結果顯示：在前者，目的基因轉移效率顯著提高，5-FC的IC50為136.6μmol，而后者的IC50達24651μmol。
胰腺癌癌基因ERBB2在多種腫瘤尤其在胰腺癌、乳腺癌等腫瘤組織中呈高表達，而在正常和炎癥胰腺組織未見這種高表達，因此，Harris等以ERBB2轉錄調節(jié)序列中一含544個堿基對的DNA片段啟動CD基因，選擇逆轉錄病毒載體轉染胰腺癌細胞HPAF、Panc1和乳腺癌細胞T3M4，HPAF細胞呈高表達、Panc1細胞呈中度表達、而T3M4細胞不表達ERBB2。檢測結果表明未轉染的上述三種細胞檢測不出CD酶活性，而轉染后其CD酶活性分別為每分鐘958.3、344.5和0pmol/109(每分鐘109細胞產(chǎn)生尿嘧啶的微摩爾量）。在前兩組，給予5-FC后，轉染CD的胰腺癌細胞生長明顯受抑，而在T3M4組，細胞生長則未見明顯改變。近來，Evoy等報道選用腺病毒載體，成功將CD基因轉染胰腺癌細胞，同樣在體內、體外觀察到明顯的抗腫瘤效應。
胃癌大約40%的胃癌表達CEA，Lan等采用CEA啟動子作為靶向性因子，構建了重組病毒載體AdCEA-Lacz和AdCEA-CD，分別轉染CEA陽性胃癌細胞系MKN45、MKN28和CEA陰性胃癌細胞MKN1，體內和體外試驗顯示Lacz基因選擇性只在CEA陽性胃癌細胞中表達；另外，AdCEA-CD轉導后上述三類細胞對5-FC的敏感性各有不同，5-FC的IC50分別是88、307和16935μmol，細胞對5-FC的敏感性分別提高了73、267和1.1倍。
結語
無論是RV還是Ad載體，均不是理想的基因轉移載體，設計安全、高效、穩(wěn)定、特異、可控、簡便易行并可攜帶不同長度DNA的新載體仍是基因治療研究中急待解決的問題；另外，綜觀某些文獻，對照組設置均為各種腫瘤細胞，缺乏腫瘤細胞與骨髓細胞、腸上皮細胞和生殖細胞等化療藥物敏感組織細胞的比較，研究基因治療腫瘤的目的不是為了比較各種腫瘤細胞間的差異，而應比較腫瘤與癌旁組織和其它正常組織細胞間的差異；再者，某些體內實驗結果尚難確定其對實驗性腫瘤具有治療作用亦或預防作用。
盡管如此，現(xiàn)有的研究已證實CD基因治療的廣泛性和有效性，并且，由于5-FC和5-FC在臨床上使用廣泛，藥代動力學亦較清楚，可采用成熟的檢測手段證實轉染結果和避免藥物過量所致的損傷作用。當前，CD基因治療消化道腫瘤的發(fā)展趨勢為采用組織特異性調控元件作為細胞靶向性因子提高轉導的選擇性，而新的生物治療模式如聯(lián)合基因治療或者設計以CD基因為基礎的瘤苗進行基因免疫治療將是未來研究的重要方向。
胞嘧啶脫氨酶基因導入腫瘤細胞可將無毒性的原藥在腫瘤細胞內代謝為具細胞毒的產(chǎn)物而發(fā)揮抗腫瘤效應。本文綜述了該基因的克隆、作用機制和在消化道腫瘤治療中的研究進展。
隨著分子生物學的迅猛發(fā)展，基因治療這一嶄新方法盡管還多處于實驗研究手段，卻已顯示出良好的應用前景。自1991年Huber等提出病毒導向的酶解原藥療法以來，有關的基因研究成為熱門課題。目前，一個新的基因治療系統(tǒng)——EC-CD/5-FC系統(tǒng)正日益受到高度關注。本文就胞嘧啶脫氨酶基因治療消化道腫瘤的現(xiàn)狀作一綜述。
CD基因的克隆
胞嘧啶脫氨酶是大腸桿菌代謝旁路中的一種酶，哺乳動物細胞中不含該酶。Austin等于1992年首先從大腸桿菌株中采用傳統(tǒng)方法提取質粒DNA，進一步分離、純化并轉染宿主菌，初步構建成原核細胞中表達的CD質粒載體，克隆了編碼CD的大腸桿菌基因，利用陽性基因篩選方法，獲得一攜帶10.8kb的DNA插入質粒，其中一3kb的DNA片段保留有CD酶活性。CK蛋白質分子量為52000，DNA序列分析顯示一含427個氨基酸開放讀碼框架編碼CD。
為證實CD基因在真核細胞中表達以發(fā)揮作用，研究者采用寡核苷酸突變技術，將CD基因起始密碼子由GTG→ATG，從而產(chǎn)生一5’起始密碼子，選擇pRc/CMV真核表達載體，構建成真核表達質粒pCMV/CD-1。以脂質體法將pCMV/CD-1導入人結腸癌WiDr細胞系，生長抑制試驗顯示轉染后的結腸癌細胞對5-FC的IC50為30μmol，而未轉染的結腸癌細胞其IC50為17000μmol，表明轉染有CD基因的結腸癌細胞對5-FC的敏感性提高了近560倍。
CD基因轉移方法
安全有效的基因轉移方法是基因治療的關鍵因素之一。至今，作為基因轉移的載體，以病毒性載體介導的方法研究為系統(tǒng)深入，幾乎應用于所有的靶系統(tǒng)。在消化道腫瘤的CD基因治療中，既往的研究仍選擇逆轉錄病毒載體，這與對其基因組結構和生活周期了解得較清楚有關。RV載體大多由Moloney小鼠白血病病毒構建而成，為RNA病毒，基因組編碼在一條單鏈RNA分子上，進入細胞后，逆轉錄成雙鏈DNA，此DNA進入細胞核整合在受體細胞DNA上，并以此為模板合成病毒基因和后代RNA。采用RV轉導CD基因，將CD基因整合于病毒長末端重復的末端，因而整合后的病毒基因結構可受到保護不致受損。
目前轉導CD基因多選擇腺病毒載體。由于腺病毒為一雙鏈DNA病毒，宿主范圍廣泛，尤其能有效地感染非分裂狀態(tài)的細胞，另外，它不能整合到宿主細胞染色體上，因而較逆轉錄病毒更為安全。重組腺病毒載體主要來自于2型和5型腺病毒，容量大，可裝載達7.6kb。已有學者選用Ad載體介導CD基因轉染入結腸癌HT29細胞系，將攜帶有大腸桿菌標記基因的腺病毒注射到腫瘤組織中底物X-gal染色來判斷基因轉染效率。結果顯示外源基因經(jīng)單次注入后近5%-30%的腫瘤組織表達Lacz基因。
作用機制
由于哺乳動物細胞中不存在CD，因而不能將胞嘧啶轉化成尿嘧啶，更不能將5-氟胞嘧啶轉化成5-氟尿嘧啶。但通過基因轉移技術將CD基因轉入哺乳動物細胞，則哺乳動物細胞可將一些原來無毒性的原藥轉化為有細胞毒性的代謝產(chǎn)物，導致細胞自殺性死亡。5-FC在高度抗微生物活性的濃度下對哺乳動物無毒性作用，經(jīng)CD脫氨為5-FU，后者則具有高度細胞毒性，為臨床廣泛使用的抗腫瘤化療藥物。
CD基因作用的一個十分突出特點即所謂的“旁觀者效應”，這與某些自殺基因的作用機制相似。Hirschowitz等早觀察到CD基因治療結腸癌時的這一效應，當CD+的結腸癌細胞與CD-的結腸癌細胞混合時，比較了CD+的細胞比例為10%和100%時兩者的細胞生長抑制水平，結果無顯著性差異。對旁觀者效應尚缺乏確切的解釋，但大多同意“縫隙連接”引起旁觀者效應，通過細胞間的接觸，毒性代謝產(chǎn)物由“縫隙連接”從CD+的細胞轉入CD-的細胞，從而使得后者變得原藥也敏感了，并被原藥代謝產(chǎn)物殺死。但亦有學者提出不同意見，Trinh等通過電鏡發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織鄰近區(qū)域有大量的“橋?！贝嬖?，因其起著封閉細胞間轉運的作用，推測旁觀者效應并非上述機制，尚有其它機制參與，如細胞凋亡、原藥代謝產(chǎn)物本身可穿過細胞膜等可能機制。
幾種消化道腫瘤CD基因治療現(xiàn)狀
結腸癌CD基因治療的研究對象以結腸癌為多。Huber等觀察到*鼠5-FC的半衰腸期大約是40分鐘，腹腔內給予500mg/的5-FC，其血漿水平可維持在4000μmol。體外試驗顯示：對于CD+結腸癌細胞，5-FC的IC50僅為5μmol；而體內試驗結果表明無論是腹腔內還是靜脈內給予5-FC，都同樣觀察到明顯的抗腫瘤效應。
Richard等將組織特異性因子癌胚抗原轉錄調控序列的三個部分分別插入到含CD基因的pCMV/CD-1中，構建了一系列pCEA/CD基因載體，通過分析熒光素活性，篩選出活性高的pCEA/CD-145基因。體外實驗將其轉導入大腸癌NCIH508細胞中，在5-FC存在下，基因表達發(fā)揮出良好的原藥轉換抗腫瘤效應，CD+的NCIH508細胞其IC50＜2μmol，而CD－的NCIH508細胞其IC50達516μmol。體內實驗比較轉導前后的大腸癌細胞*鼠體內成瘤后，給予5-FU500μg(kgd，），連續(xù)20日，細果顯示未轉導CD的大腸癌細胞成瘤*鼠腫瘤重量增加了近3倍，而轉導CD的大腸癌細胞成瘤*鼠腫瘤重量基本未改變。
肝腫瘤肝原發(fā)或繼發(fā)腫瘤的基因治療研究報道多。由于肝臟是結腸癌常轉移的部位，因此，Ohwada等在建立結腸癌肝轉移動物模型的基礎上，給予人結腸癌荷瘤*鼠肝內注射AdCMV.CD和腹腔內每周二次給予5-FC，以點雜交分析肝內人結腸癌細胞DNA數(shù)量來判斷抑制轉移瘤效果。結果與對照組相比，治療組肝內人結腸癌細胞DNA數(shù)量顯著低于各對照組，級組織學檢查顯示治療組注射部位肝腫瘤出現(xiàn)壞死，對照組未見此現(xiàn)象，且治療組中正常肝組織僅見輕微的、可恢復的炎癥，未見壞死。
近，Kanai等報道選擇甲胎蛋白啟動子/增強子，構建重組腺病毒載體AdAFP-CD和AdAFP-Lacz，分別轉染AFP+的肝癌細胞系和AFP-的肝癌細胞系，結果顯示：在前者，目的基因轉移效率顯著提高，5-FC的IC50為136.6μmol，而后者的IC50達24651μmol。
胰腺癌癌基因ERBB2在多種腫瘤尤其在胰腺癌、乳腺癌等腫瘤組織中呈高表達，而在正常和炎癥胰腺組織未見這種高表達，因此，Harris等以ERBB2轉錄調節(jié)序列中一含544個堿基對的DNA片段啟動CD基因，選擇逆轉錄病毒載體轉染胰腺癌細胞HPAF、Panc1和乳腺癌細胞T3M4，HPAF細胞呈高表達、Panc1細胞呈中度表達、而T3M4細胞不表達ERBB2。檢測結果表明未轉染的上述三種細胞檢測不出CD酶活性，而轉染后其CD酶活性分別為每分鐘958.3、344.5和0pmol/109(每分鐘109細胞產(chǎn)生尿嘧啶的微摩爾量）。在前兩組，給予5-FC后，轉染CD的胰腺癌細胞生長明顯受抑，而在T3M4組，細胞生長則未見明顯改變。近來，Evoy等報道選用腺病毒載體，成功將CD基因轉染胰腺癌細胞，同樣在體內、體外觀察到明顯的抗腫瘤效應。
胃癌大約40%的胃癌表達CEA，Lan等采用CEA啟動子作為靶向性因子，構建了重組病毒載體AdCEA-Lacz和AdCEA-CD，分別轉染CEA陽性胃癌細胞系MKN45、MKN28和CEA陰性胃癌細胞MKN1，體內和體外試驗顯示Lacz基因選擇性只在CEA陽性胃癌細胞中表達；另外，AdCEA-CD轉導后上述三類細胞對5-FC的敏感性各有不同，5-FC的IC50分別是88、307和16935μmol，細胞對5-FC的敏感性分別提高了73、267和1.1倍。
結語
無論是RV還是Ad載體，均不是理想的基因轉移載體，設計安全、高效、穩(wěn)定、特異、可控、簡便易行并可攜帶不同長度DNA的新載體仍是基因治療研究中急待解決的問題；另外，綜觀某些文獻，對照組設置均為各種腫瘤細胞，缺乏腫瘤細胞與骨髓細胞、腸上皮細胞和生殖細胞等化療藥物敏感組織細胞的比較，研究基因治療腫瘤的目的不是為了比較各種腫瘤細胞間的差異，而應比較腫瘤與癌旁組織和其它正常組織細胞間的差異；再者，某些體內實驗結果尚難確定其對實驗性腫瘤具有治療作用亦或預防作用。
盡管如此，現(xiàn)有的研究已證實CD基因治療的廣泛性和有效性，并且，由于5-FC和5-FC在臨床上使用廣泛，藥代動力學亦較清楚，可采用成熟的檢測手段證實轉染結果和避免藥物過量所致的損傷作用。當前，CD基因治療消化道腫瘤的發(fā)展趨勢為采用組織特異性調控元件作為細胞靶向性因子提高轉導的選擇性，而新的生物治療模式如聯(lián)合基因治療或者設計以CD基因為基礎的瘤苗進行基因免疫治療將是未來研究的重要方向。