第五章 分光光度法
第一節(jié) 紫外—可見分光光度法
一、基本原理
紫外—可見吸收光譜屬分子吸收光譜，是由分子的外層價電子躍遷產(chǎn)生的。
Lambert-Beer定律 A=ECL
A為吸收度，E為吸收系數(shù)，C為被測物質溶液濃度，L為光路長度。吸收系數(shù)E是物質的物理常數(shù)，隨濃度C單位的不同有不同表示方法。
藥品檢驗中使用百分吸收系數(shù) ，物理意義是當吸光物質溶液濃度為1%(1g/100 ml)，液層厚度為1cm時的吸收度。
二、可見-紫外分光光度計
光源-單色器-吸收池-檢測器-數(shù)據(jù)記錄和處理
1.光源：紫外區(qū)采用氫燈或氘燈，可見光區(qū)采用鎢燈
2.單色器：狹縫寬度大，單色光純度差;寬度過小，檢測靈敏度降低
3.吸收池：玻璃池適用于370nm以上的可見光區(qū)，石英池適用于紫外、可見光區(qū)，通常僅在紫外光區(qū)使用
三、吸收度的測定方法
1.對溶劑的要求：能充分溶解樣品，與樣品無相互作用，揮發(fā)性小，在測定波長處的吸收應符合要求
2.空白對照實驗：將溶劑裝入?yún)⒈瘸?，調(diào)節(jié)吸收度為0，去除溶劑和容器吸收、光散射、反射的影響。
3.測定波長確證
4.供試品溶液濃度：使吸收度在0.3～0.7范圍內(nèi)。
5.狹縫寬度：以減少狹縫寬度時，供試品溶液吸收度不再增加為準。
四、應用
1.鑒別
(1) 對比吸收光譜特征參數(shù)：核對供試品溶液λmax、 、A是否符合規(guī)定?？赏瑫r用幾個峰位作為鑒別依據(jù)
(2) 比較吸收度比值一致性：吸收峰較多時，規(guī)定幾個波長處吸收度比值作為鑒定標準
(3) 對比吸收光譜一致性
2.雜質檢查
藥物在紫外-可見光區(qū)有明顯吸收，而雜質吸收弱;或雜質有明顯吸收而藥物無吸收，可通過控制吸收度限度來控制雜質量。
3.含量測定
(1) 對照品比較法：供試品溶液和對照品溶液濃度及測定條件應盡可能一致
(2) 吸收系數(shù)法：需對儀器進行嚴格校正和檢定
(3) 計算分光光度法：通過數(shù)學處理消除樣品中干擾組分的干擾
(4) 比色法：供試品與對照品同時操作
第二節(jié) 熒光分析法
一、基本原理
熒光的產(chǎn)生：此化學物質能從外界吸收并儲存能量(如光能、化學能等)而進入激發(fā)態(tài)，當其從激發(fā)態(tài)再回復到基態(tài)時，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射(即發(fā)光)。熒光發(fā)射的特點是：可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光;而一旦停止供能，發(fā)光(熒光)現(xiàn)象也隨之在瞬間內(nèi)消失。
發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強度，除受激發(fā)光強度影響外，也與激發(fā)光的波長有關。各個熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜(熒光光譜)，即在某一特定波長處有吸收峰和發(fā)射峰。選擇激發(fā)光波長量接近于熒光分子的吸收峰
物質的激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜，可以用作該物質的定性分析。當激發(fā)光強度、波長、所用溶劑及溫度等條件固定時，物質在一定濃度范圍內(nèi)，其發(fā)射光強度與溶液中該物質的濃度成正比關系，可以用作定量分析。熒光分析法的靈敏度一般較紫外分光光度法或比色法為高，濃度太大的溶液會有“自熄滅”作用，故熒光分析法應在低濃度溶液中進行。
二、熒光分光光度計
激發(fā)光源→激發(fā)光單色器→樣品池
↓
發(fā)射光單色器→檢測器→數(shù)據(jù)記錄處理
樣品池用低熒光材料制成，四面透光，發(fā)射光方向與激發(fā)光成直角。
三、應用
熒光分析可用于鑒別和含量測定。一般采用對照品比較法測定含量，靈敏度高、選擇性好，但干擾多、線性范圍窄，多用于需要高靈敏度和允許較大變異性的樣品分析。
第三節(jié) 紅外分光光度法
一、基本原理
紅外光譜是由分子的振動、轉動能極引起的光譜。當用一定頻率的紅外光照射某物質分子時，若該物質的分子中某基團的振動頻率與它相同，則此物質就能吸收這種紅外光，使分子由振動基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)。
因此，若用不同頻率的紅外光依次通過測定分子時，就會出現(xiàn)不同強弱的吸收現(xiàn)象。用T%-λ作圖就得到其紅外光吸收光譜。紅外光譜具有很高的特征性，每種化合物都具有特征的紅外光譜。用它可進行物質的結構分析和定量測定。
二、紅外光譜儀
光源-吸收池-單色器-檢測器-數(shù)據(jù)記錄和處理
三、紅外光譜與物質結構的關系
一般將振動形式分成兩類：伸縮振動和變形振動。
(1)伸縮振動
表示。n 原子沿鍵軸方向伸縮，鍵長發(fā)生變化而鍵角不變的振動稱為伸縮振動，用符號ν
(2)變形振動(又稱彎曲振動或變角振動)
基團鍵角發(fā)生周期變化而鍵長不變的振動稱為變形振動，面內(nèi)變形振動又分為剪式(以δ表示)和平面搖擺振動。
紅外光譜區(qū)可分成4000 cm-1 ~1300cm-1和1300 cm-1 ~ 400 cm-1兩個區(qū)域。最有分析價值的基團頻率在4000 cm-1 ~ 1300 cm-1 之間，這一區(qū)域稱為基團頻率區(qū)、官能團區(qū)或特征區(qū)。區(qū)內(nèi)的峰是由伸縮振動產(chǎn)生的吸收帶，比較稀疏，容易辨認，常用于鑒定官能團。
四、應用
1鑒別：紅外光譜特征性強，鑒別時按《藥品紅外光譜集》中收載的制備方法制備，與該品種對照圖譜比較應一致。
2.檢查：依據(jù)藥物與其同質異晶雜質在特定波數(shù)的吸收有顯著差異，對無效或低效晶型進行檢查
【A型題】
1溶液的厚度不變時，吸收系數(shù)的大小取決于
A光的波長 B溶液濃度
C光線強弱 D溶液顏色
E儀器性能
參考答案B
2紫外分光光度法測定藥物含量時，應采用
A石英管 B石英吸收池
C玻璃比色皿 D玻璃吸收池
E樣品室
參考答案B
3紫外-可見吸收光譜屬于
A電子躍遷光譜 B分子振動光譜
C發(fā)射光譜 D熒光光譜
E原子吸收光譜
參考答案A
4在測定吸收度時，為消除溶劑及其他因素的影響，一般需用
A空白校正 B溶劑校正
C儀器校正 D波長校正
E對照實驗
參考答案A
5采用紫外-可見分光光度法測定藥物含量時，配制待測溶液濃度應使
A測得吸收度盡量大
B吸收度大于0.1
C吸收度大于0.7
D吸收度在0.1～0.8
E吸收度在0.3～0.7
參考答案E
6紅外吸收光譜又稱
A吸收光譜 B電子躍遷光譜
C分子振動光譜 D分子轉動光譜
E分子振動-轉動光譜
參考答案E
7被分離組分在固定相與流動相之間分配達到平衡時濃度比稱為
A濃度比 B質量比
C分配系數(shù) D容量因子
E質量分配系數(shù)
參考答案C
8TLC的Rf值范圍是
A0.1～0.9 B0.2～0.8
C0.3～0.5 D0.4～0.6
E0.3～0.7
參考答案C
9 HPLC最常用的檢測器是
A熱導檢測器
B電子捕獲檢測器
C氫火焰離子化檢測器
D熒光檢測器
E紫外檢測器
參考答案E
【B型題】
A3300～3000cm-1
B1300～1000cm-1
C1900～1650cm-1
D1000～650cm-1
E3750～3000cm-1
1νOH或νNH
2ν≡H
3νC-O
4νC=O
參考答案1E 2A 3B 4C
A峰高 B峰面積
C峰寬 D調(diào)整保留時間
E峰位
5用于定量測定的色譜參數(shù)
6用于衡量柱效的參數(shù)
7用于鑒別藥物的色譜參數(shù)
8被分離組分在固定相中停留時間
參考答案5B 6C 7E 8D
【X型題】
1用于藥物含量測定的紫外分光光度法
A吸收系數(shù)法 B計算分光光度法
C對照品比較法 D自身對照法
E靈敏度法
參考答案ABC
2TLC中影響Rf值的主要因素有
A被分離物質特性 B薄層板性質
C展開劑性質 D展開時間
E展開室內(nèi)展開劑的飽和度
參考答案ABCE
3中國藥典規(guī)定正文項下色譜條件不得任意改變者有
A檢測器種類 B固定液品種
C特殊指定的色譜材料
D進樣量 E載氣
參考答案ABC
5內(nèi)標法中內(nèi)標物應具備的條件
A保留時間與待測物相近
B與待測物分離度大于1.5
C符合要求的純物質
D待測樣品中不含有的組分
E待測樣品與內(nèi)標的相應信號比值應和待測樣品濃度成正比
參考答案ABCDE
第一節(jié) 紫外—可見分光光度法
一、基本原理
紫外—可見吸收光譜屬分子吸收光譜，是由分子的外層價電子躍遷產(chǎn)生的。
Lambert-Beer定律 A=ECL
A為吸收度，E為吸收系數(shù)，C為被測物質溶液濃度，L為光路長度。吸收系數(shù)E是物質的物理常數(shù)，隨濃度C單位的不同有不同表示方法。
藥品檢驗中使用百分吸收系數(shù) ，物理意義是當吸光物質溶液濃度為1%(1g/100 ml)，液層厚度為1cm時的吸收度。
二、可見-紫外分光光度計
光源-單色器-吸收池-檢測器-數(shù)據(jù)記錄和處理
1.光源：紫外區(qū)采用氫燈或氘燈，可見光區(qū)采用鎢燈
2.單色器：狹縫寬度大，單色光純度差;寬度過小，檢測靈敏度降低
3.吸收池：玻璃池適用于370nm以上的可見光區(qū)，石英池適用于紫外、可見光區(qū)，通常僅在紫外光區(qū)使用
三、吸收度的測定方法
1.對溶劑的要求：能充分溶解樣品，與樣品無相互作用，揮發(fā)性小，在測定波長處的吸收應符合要求
2.空白對照實驗：將溶劑裝入?yún)⒈瘸?，調(diào)節(jié)吸收度為0，去除溶劑和容器吸收、光散射、反射的影響。
3.測定波長確證
4.供試品溶液濃度：使吸收度在0.3～0.7范圍內(nèi)。
5.狹縫寬度：以減少狹縫寬度時，供試品溶液吸收度不再增加為準。
四、應用
1.鑒別
(1) 對比吸收光譜特征參數(shù)：核對供試品溶液λmax、 、A是否符合規(guī)定?？赏瑫r用幾個峰位作為鑒別依據(jù)
(2) 比較吸收度比值一致性：吸收峰較多時，規(guī)定幾個波長處吸收度比值作為鑒定標準
(3) 對比吸收光譜一致性
2.雜質檢查
藥物在紫外-可見光區(qū)有明顯吸收，而雜質吸收弱;或雜質有明顯吸收而藥物無吸收，可通過控制吸收度限度來控制雜質量。
3.含量測定
(1) 對照品比較法：供試品溶液和對照品溶液濃度及測定條件應盡可能一致
(2) 吸收系數(shù)法：需對儀器進行嚴格校正和檢定
(3) 計算分光光度法：通過數(shù)學處理消除樣品中干擾組分的干擾
(4) 比色法：供試品與對照品同時操作
第二節(jié) 熒光分析法
一、基本原理
熒光的產(chǎn)生：此化學物質能從外界吸收并儲存能量(如光能、化學能等)而進入激發(fā)態(tài)，當其從激發(fā)態(tài)再回復到基態(tài)時，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射(即發(fā)光)。熒光發(fā)射的特點是：可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光;而一旦停止供能，發(fā)光(熒光)現(xiàn)象也隨之在瞬間內(nèi)消失。
發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強度，除受激發(fā)光強度影響外，也與激發(fā)光的波長有關。各個熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜(熒光光譜)，即在某一特定波長處有吸收峰和發(fā)射峰。選擇激發(fā)光波長量接近于熒光分子的吸收峰
物質的激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜，可以用作該物質的定性分析。當激發(fā)光強度、波長、所用溶劑及溫度等條件固定時，物質在一定濃度范圍內(nèi)，其發(fā)射光強度與溶液中該物質的濃度成正比關系，可以用作定量分析。熒光分析法的靈敏度一般較紫外分光光度法或比色法為高，濃度太大的溶液會有“自熄滅”作用，故熒光分析法應在低濃度溶液中進行。
二、熒光分光光度計
激發(fā)光源→激發(fā)光單色器→樣品池
↓
發(fā)射光單色器→檢測器→數(shù)據(jù)記錄處理
樣品池用低熒光材料制成，四面透光，發(fā)射光方向與激發(fā)光成直角。
三、應用
熒光分析可用于鑒別和含量測定。一般采用對照品比較法測定含量，靈敏度高、選擇性好，但干擾多、線性范圍窄，多用于需要高靈敏度和允許較大變異性的樣品分析。
第三節(jié) 紅外分光光度法
一、基本原理
紅外光譜是由分子的振動、轉動能極引起的光譜。當用一定頻率的紅外光照射某物質分子時，若該物質的分子中某基團的振動頻率與它相同，則此物質就能吸收這種紅外光，使分子由振動基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)。
因此，若用不同頻率的紅外光依次通過測定分子時，就會出現(xiàn)不同強弱的吸收現(xiàn)象。用T%-λ作圖就得到其紅外光吸收光譜。紅外光譜具有很高的特征性，每種化合物都具有特征的紅外光譜。用它可進行物質的結構分析和定量測定。
二、紅外光譜儀
光源-吸收池-單色器-檢測器-數(shù)據(jù)記錄和處理
三、紅外光譜與物質結構的關系
一般將振動形式分成兩類：伸縮振動和變形振動。
(1)伸縮振動
表示。n 原子沿鍵軸方向伸縮，鍵長發(fā)生變化而鍵角不變的振動稱為伸縮振動，用符號ν
(2)變形振動(又稱彎曲振動或變角振動)
基團鍵角發(fā)生周期變化而鍵長不變的振動稱為變形振動，面內(nèi)變形振動又分為剪式(以δ表示)和平面搖擺振動。
紅外光譜區(qū)可分成4000 cm-1 ~1300cm-1和1300 cm-1 ~ 400 cm-1兩個區(qū)域。最有分析價值的基團頻率在4000 cm-1 ~ 1300 cm-1 之間，這一區(qū)域稱為基團頻率區(qū)、官能團區(qū)或特征區(qū)。區(qū)內(nèi)的峰是由伸縮振動產(chǎn)生的吸收帶，比較稀疏，容易辨認，常用于鑒定官能團。
四、應用
1鑒別：紅外光譜特征性強，鑒別時按《藥品紅外光譜集》中收載的制備方法制備，與該品種對照圖譜比較應一致。
2.檢查：依據(jù)藥物與其同質異晶雜質在特定波數(shù)的吸收有顯著差異，對無效或低效晶型進行檢查
【A型題】
1溶液的厚度不變時，吸收系數(shù)的大小取決于
A光的波長 B溶液濃度
C光線強弱 D溶液顏色
E儀器性能
參考答案B
2紫外分光光度法測定藥物含量時，應采用
A石英管 B石英吸收池
C玻璃比色皿 D玻璃吸收池
E樣品室
參考答案B
3紫外-可見吸收光譜屬于
A電子躍遷光譜 B分子振動光譜
C發(fā)射光譜 D熒光光譜
E原子吸收光譜
參考答案A
4在測定吸收度時，為消除溶劑及其他因素的影響，一般需用
A空白校正 B溶劑校正
C儀器校正 D波長校正
E對照實驗
參考答案A
5采用紫外-可見分光光度法測定藥物含量時，配制待測溶液濃度應使
A測得吸收度盡量大
B吸收度大于0.1
C吸收度大于0.7
D吸收度在0.1～0.8
E吸收度在0.3～0.7
參考答案E
6紅外吸收光譜又稱
A吸收光譜 B電子躍遷光譜
C分子振動光譜 D分子轉動光譜
E分子振動-轉動光譜
參考答案E
7被分離組分在固定相與流動相之間分配達到平衡時濃度比稱為
A濃度比 B質量比
C分配系數(shù) D容量因子
E質量分配系數(shù)
參考答案C
8TLC的Rf值范圍是
A0.1～0.9 B0.2～0.8
C0.3～0.5 D0.4～0.6
E0.3～0.7
參考答案C
9 HPLC最常用的檢測器是
A熱導檢測器
B電子捕獲檢測器
C氫火焰離子化檢測器
D熒光檢測器
E紫外檢測器
參考答案E
【B型題】
A3300～3000cm-1
B1300～1000cm-1
C1900～1650cm-1
D1000～650cm-1
E3750～3000cm-1
1νOH或νNH
2ν≡H
3νC-O
4νC=O
參考答案1E 2A 3B 4C
A峰高 B峰面積
C峰寬 D調(diào)整保留時間
E峰位
5用于定量測定的色譜參數(shù)
6用于衡量柱效的參數(shù)
7用于鑒別藥物的色譜參數(shù)
8被分離組分在固定相中停留時間
參考答案5B 6C 7E 8D
【X型題】
1用于藥物含量測定的紫外分光光度法
A吸收系數(shù)法 B計算分光光度法
C對照品比較法 D自身對照法
E靈敏度法
參考答案ABC
2TLC中影響Rf值的主要因素有
A被分離物質特性 B薄層板性質
C展開劑性質 D展開時間
E展開室內(nèi)展開劑的飽和度
參考答案ABCE
3中國藥典規(guī)定正文項下色譜條件不得任意改變者有
A檢測器種類 B固定液品種
C特殊指定的色譜材料
D進樣量 E載氣
參考答案ABC
5內(nèi)標法中內(nèi)標物應具備的條件
A保留時間與待測物相近
B與待測物分離度大于1.5
C符合要求的純物質
D待測樣品中不含有的組分
E待測樣品與內(nèi)標的相應信號比值應和待測樣品濃度成正比
參考答案ABCDE